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Chromatographie

Die Chromatographie ist ein zentrales biophysikalische Verfahren, das die Trennung, Identifizierung, Quantifizierung und Reinigung von Komponenten einer Mischung für die qualitative und quantitative Analyse ermöglicht.

Das Verfahren beruht auf den spezifischen Wechselwirkungen der zu trennenden Komponenten mit zwei nicht mischbaren Phasen, einer stationären und einer mobilen Phase. Substanzen können auf der Grundlage einer Vielzahl von Methoden und dem Vorhandensein von Eigenschaften wie Größe und Form, Gesamtladung, an der Oberfläche vorhandene hydrophobe Gruppen und Bindungskapazität mit der stationären Phase getrennt werden.

In der Chromatographie werden daher je nach Zusammensetzung der Phasen zwischen unterschiedlichen Trennverfahren bzw. Anwendungen unterschieden.

Was auch immer Sie benötigen – Carl ROTH bietet Ihnen ein umfangreiches Angebot für ihr erfolgreiches Chromatographie-Labor. 
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Gas-Chromatographie (GC)
Die Gaschromatographie (GC) ist ein sehr weit verbreitetes analytisches Verfahren zur Trennung flüchtiger Verbindungen in einem kontinuierlichen Gasstrom, der mobilen Phase. Grundprinzip für den Trennvorgang ist dabei, dass die Bestandteile einer Probe unterschiedliche Dampfdrücke haben und so unterschiedlich schnell in die Gasphase übergehen.

Ein inertes Gas (auch Trägergas genannt) übernimmt dabei den Transport der zu trennenden Komponenten und wechselwirkt weder mit der Probe noch mit den Bestandteilen der Säule. Übliche Gase für die Gaschromatographie sind z. B. Stickstoff (N2), Helium (He) und Wasserstoff (H2). Die zum Einsatz kommenden stationären Phasen werden formell klassifiziert in die sog. gepackten Säulen und die Kapillarsäulen. Heutzutage werden überwiegend Kapillarsäulen verwendet. Dort ist die stationäre Phase auf der Innenseite der Säule als hochmolekulare, wenig flüchtige Flüssigkeit gleichmäßig wie ein Mantel aufgetragen, wodurch die zurückgelegte Weglänge der einzelnen Moleküle in der Gasphase weniger variiert. Dadurch kommt es – im Gegensatz zu gepackten Säulen, welche den gesamten Hohlraum der Säule ausfüllt – zu einer erhöhten Trennleistung.
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Die GC zeichnet sich durch ihre hohe Empfindlichkeit, ihre gute Reproduzierbarkeit für genaue quantitative Bestimmungen sowie ihre vielfältigen Anwendungsgebiete aufgrund der großen Auswahlmöglichkeiten an stationären Phasen aus.

Bei Carl Roth finden Sie für jede Anwendung das richtige Produkt.
Flüssigkeits-Chromatographie (LC, HPLC, LC-MS)
Die Flüssigchromatographie (engl.: LC Liquid Chromatography) ist eine Sammelbezeichnung für alle chromatographischen Methoden, bei denen Flüssigkeiten als mobile Phase verwendet werden.

Darunter fallen folgende Trennverfahren:
  • Papierchromatographie (PC),
  • Dünnschichtchromatographie (DC) und
  • Säulenchromatographie
    • Niederdruckflüssigkeitschromatographie / Flash-Chromatographhie (FC)
    • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
    • Ionenaustauschchromatographie (IC)
    • Gel-Permeations-Chromatographie (GPC)
    • Adsorptions- / Affinitätschromatographie (AC)

Diese Trennmethode basiert darauf, dass sich Substanzen eines Gemisches in der mobilen Phase gelöst werden und mit ausreichender Selektivität mit der stationären Phase wechselwirken. Es kommt entsprechend den Moleküleigenschaften zu einem Sortierprozess durch die stationäre Phase. Die Zusammensetzung der mobilen Phase kann – je nach Art der zu trennenden Substanzen – auch schrittweise verändert werden (Gradient). Dies ermöglicht eine Methodenvielfalt, mit der heute ganz unterschiedliche Substanzklassen untersucht werden können. Aus der klassischen Säulenchromatographie hat sich die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (engl.: HPLC High Performance Liquid Chromatography) entwickelt. Eine bessere Auftrennung konnte erreicht werden, indem die Teilchengröße des Säulenmaterials auf unter 10 μm verkleinert wurde. Dadurch wird jedoch ein höherer Druck benötigt, um die mobile Phase durch die Säule zu bewegen. Die HPLC führt zu höheren Auflösung bei der Trennung, höherer Genauigkeit und Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit in kürzerer Zeit als bei herkömmlichen Methoden.
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Die HPLC ist eine hochauflösende Technik zur Trennung und Quantifizierung einer Reihe von kleinen Molekülen, Biomolekülen und Peptiden. Sie eignet sich besonders für die Untersuchung von Substanzen, die schwerflüchtig oder nicht flüchtig sind sowie bei stark polaren oder ionischen Substanzen, Substanzen mit hohem Molekulargewicht und thermisch instabilen, leicht zersetzbaren Substanzen. Sie fungiert als eines der meistgenutzten Techniken in der instrumentellen Analytik, kann aber auch zur präparativen Aufbearbeitung von Verbindungen genutzt werden.

Die entstehende physikalische Information wird am Ende der Säule der HPLC-Anlage durch verschiedene Arten von Detektoren in elektrische Signale (Analogsignale) umgewandelt. Sie machen die analytische Information der chromatographischen Trennung messbar und sichtbar. Dabei wird nicht die zurückgelegte Wegstrecke, sondern die Zeit (Retentionszeit tR), die die einzelnen Bestandteile brauchen, um das gesamte Packungsmaterial zu durchqueren gemessen.

Die Identifikation und/oder Quantifizierung der Substanzen ist auch über die Kopplung von Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie (LC-MS, HPLC-MS) möglich.
Maximieren Sie die Leistung Ihres HPLC-Systems. Carl ROTH bietet Ihnen hochwertige Lösungsmittel für HPLC und LC-MS, Vergleichssubstanzen, Autosampler-Fläschchen und anderes HPLC-Zubehör.
Dünnschicht-Chromatographie (DC, HPTLC)
Die Dünnschichtchromatographie (DC, engl.: TLC Thin Layer Chromatography) ist ein analytisches und präparatives Trennverfahren der Planarchromatographie. Sie erlaubt es, schnell und mit geringem Kostenaufwand, eine vorliegende Probe in ihre Bestandteile zu trennen und diese zu bestimmen.

Das Trennprinzip der Dünnschichtchromatographie beruht darauf, dass sich die flüssige mobile Phase (Lösemittel sowie Lösemittelgemische; auch Laufmittel genannt) aufgrund von Kapillareffekten durch ein geeignetes Sorbens (Sorptionsmittel) als stationäre Phase bewegt. Die stationäre Phase befindet sich dabei als dünne Schicht auf verschiedenen Trägermaterialien (Glas, Polyester oder Aluminium). An dieser Schicht erfolgt die Trennung durch Elution mit dem Laufmittel. Dabei existiert für jeden Bestandteil der Probe ein dynamisches Gleichgewicht zwischen flüssiger, im Laufmittel gelöster Phase, und adsorbierter Phase.

Die einzelnen Bestandteile der Probe werden unterschiedlich weit mit der mobilen Phase transportiert und sind im Chromatogramm als getrennte Punkte zu erkennen. Die aufgetrennten Substanzen sind im besten Fall so gefärbt, dass die Lage der Bande anhand der Eigenfarbe der Substanz erkennbar ist. Anderenfalls können sie unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Enthält das Schichtmaterial einen Fluoreszenzindikator, erscheinen diese Substanzen als dunkle Flecken durch Fluoreszenzquenchung ("Fluoreszenzlöschung"). Falls sie unter UV-Licht nicht erscheinen, kann man die Probe auch mit Chromophoren derivatisieren, durch die sie eine mit dem Auge sichtbare Farbe erhält, wobei die notwendigen Reagenzien entweder aufgesprüht oder im Tauchverfahren aufgebracht werden.

Um verschiedene DCs vergleichen zu können, werden die so genannten Rf-Werte (Retentionsfaktor) berechnet. Als Definition des Rf-Wertes gilt das Verhältnis der Wanderungsstrecke der Substanz (S) zur Wanderungsstrecke der Laufmittelfront (L):



Dadurch kann eine Vergleichbarkeit zwischen den Ergebnissen verschiedener Dünnschichtchromatogrammen hergestellt werden, da dieser Wert bei gleicher Wahl der Zusammensetzung der mobilen Phase und der stationären Phase eine für jeden Stoff spezifische Konstante ist. Somit können einzelne Bestandteile auch durch Vergleiche mit einer Referenz identifiziert werden.

Als analytische Methode ist die Dünnschichtchromatographie hervorragend dazu geeignet, das richtige Laufmittelverhältnis für anschließende präparative Verfahren (z. B. Säulenchromatographie) zu finden.

Im Vergleich zur Papierchromatographie (PC) zeigt die Dünnschichtchromatographie zahlreiche Vorteile:
  • bessere Auftrennung der Stoffe,
  • schnellere Auftrennung,
  • robuste stationäre Phase und robuster Träger (Nachweisreagenzien nahezu frei auswählbar),
  • verschiedene stationäre Phasen verwendbar.
Durch diese Weiterentwicklungen hat die Dünnschichtchromatographie die Papierchromatographie weitestgehend aus der Routineanalytik verdrängt.
Neben den klassischen Kieselgel-Schichten gibt es bereits ein breites Spektrum verschiedener Alternativen am Markt:
  • High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC, Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie)
    Die HPTLC stellt eine Verbesserung der klassischen DC hinsichtlich Trennvermögen, Zeitbedarf und Materialverbrauch dar.
    Durch Verwendung Kieselgelpartikel mit einer sehr geringen Größe und einer erhöhten Packungsdichte des Gels auf der Platte wurden die Auflösung und die Genauigkeit bei der HPTLC sehr gesteigert. Die Oberfläche der Platte ist glatt und bietet eine effiziente Trennung. Schnellere Analysen mit höherer Empfindlichkeit sind möglich. Dieses Verfahren liefert äußerst reproduzierbare, scharfe Banden für quantitative Analysen und ist somit auch ideal für geräteunterstützte Anwendungen geeignet.
  • Modifizierte Kieselgelplatten
    Während unmodifiziertes Kieselgel (SiOH) an der Oberfläche polare Silanole und Siloxane trägt, werden bei oberflächenmodifizierten Kieselgelen an diese polaren Gruppen andere funktionelle Gruppen (z. B. Aminogruppen) gebunden, um damit die Oberflächeneigenschaften des Kieselgels in gewünschter Weise zu modifizieren. Sie unterscheiden sich vom Standard-Kieselgel nicht nur in ihrer Polarität, sondern auch in der Basizität und führen damit zu völlig anderen Trennergebnissen.
  • Umkehrphasenchromatographie (Reversed-Phase Thin Layer Chromatography; RP-DC, bzw. engl. RP-TLC)
    Durch die Alkylierung der Si-OH-Gruppen auf der Kieselgeloberfläche z. B. mit C2-, C4-, C8- oder C18-Ketten kehrt sich die Reihenfolge, in der die verschiedenen Probemoleküle aufgetrennt werden, um – die polaren Moleküle laufen schneller, die unpolaren Moleküle werden stärker festgehalten. Da das eine Umkehrung der klassischen Verhältnisse der Phasen ist, spricht man von "reversed phase"‑Dünnschichtchromatographie. Dies führt unter anderem dazu, dass auch stark polare Substanzen durch die Verwendung von Reversed-Phase-Kieselgel untersucht werden können.
  • Als weitere stationäre Phasen für die DC eignen sich auch Aluminiumoxid (ALOX), Magnesiumsilikat, Kieselgur, Polyamid, Cellulose.
Unsere DC- sowie HPTLC-Platten sind mit Glasplatten, POLYGRAM® Polyesterfolien und ALUGRAM® Aluminiumfolien in einer Vielfalt an Formaten erhältlich, sodass sie für zahlreiche Trennanwendungen geeignet sind. Lieferbar mit und ohne manganaktiviertes Zinksilikat als Fluoreszenzindikator mit grüner Fluoreszenz im kurzwelligen UV-Licht (254 nm, UV254).

Glasplatten: Glas, ca. 1,3 mm dick, hoher Aufwand für Verpackung und Lagerung, ideale Torsionsstabilität, hohe Temperaturstabilität, zerbrechlich, kann nicht geschnitten werden, hohe Beständigkeit gegen Lösemittel, Mineralsäuren und konz. Ammoniak, je nach Phase geeignet für wässrige Nachweisreagenzien.

POLYGRAM®: Polyester, ca. 0,2 mm dick, niedriger Aufwand für Verpackung und Lagerung, niedrige Torsionsstabilität, max. 185 Temperaturstabilität, unzerbrechlich, kann geschnitten werden, hohe Beständigkeit gegen Lösemittel, Mineralsäuren und konz. Ammoniak, gut geeignet für wässrige Nachweisreagenzien. Bindemittelsystem der POLYGRAM® Folien ist auch in rein wässrigen Eluenten stabil.

ALUGRAM®: Aluminium, ca. 0,15 mm dick, niedriger Aufwand für Verpackung und Lagerung, relativ hohe Torsionsstabilität, hohe Temperaturstabilität, unzerbrechlich, kann geschnitten werden, hohe Beständigkeit gegen Lösemittel, niedrige gegen Mineralsäuren und konz. Ammoniak, begrenzt geeignet für wässrige Nachweisreagenzien.
Säulenchromatographie (SC, Flash-Chromatographie)
Die klassische Säulenchromatographie ist ein präparatives Trennverfahren, bei dem die stationäre Phase in meist senkrecht stehende Glasrohre – Trennsäulen – eingefüllt ist. Dabei beruht die Trennung – wie bei der Dünnschichtchromatographie (DC) – auf dem unterschiedlich starken Sorbtionsverhalten verschiedener Stoffe in Lösung (mobile Phase) an der stationären Phase.

Als stationäre Phase dient meist feinpulvriges Kieselgel, Cellulose oder Aluminiumoxid. Dadurch, dass diese Materialien auch als Schichten von DC-Fertigplatten erhältlich sind, kann mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie das Trennproblem zunächst analysiert werden. Die Polarität der mobilen Phase muss möglichst genau auf das spezielle Trennproblem angepasst werden. Dazu werden Mischungen polarer und unpolarer Lösungsmittel eingesetzt.

Die verschiedenen Verbindungen des Gemischs wechselwirken je nach ihrer chemischen Beschaffenheit unterschiedlich mit der stationären Phase und werden dadurch in unterschiedlichen Fraktionen eluiert. Beschleunigt werden können derartige Trennungen, wenn die mobile Phase anstatt durch die Schwerkraftwirkung des überstehenden Lösungsmittels mit Druckluft durch die stationäre gedrückt wird (sogn. "Flash-Chromatographie"). Die Trennleistung der Säule wird durch diese Methode sogar gesteigert, da die Zonen weniger Zeit haben, durch Diffusion in Fließrichtung aufzuweiten. Im Gegensatz zur HPLC werden die Substanzgemische bei der Flash Chromatographie auf Normalphasen (häufig unmodifiziertes Kieselgel) unter Anwendung eines eher geringen Drucks (2–25 bar) getrennt.

Die Flash-Chromatographie eignet sich besonders zur präparativen Reinigung größerer Stoffmengen vom Mikrogramm- bis Kilogramm-Maßstab. Gegenüber der präparativen HPLC-Trennung ist diese Trennmethode weniger zeit- und kostenintensiv. Sie lässt sich entweder manuell mit geringem apparativem Aufwand durchführen oder automatisiert mit entsprechenden Geräten.

Bei Carl ROTH finden Sie eine große Auswahl an vorgepackten Säulen in Form von Kunststoffkartuschen mit verschiedenen Packungsmaterialien, selbst zu packende Glassäulen sowie weiteres Zubehör für die Flash-Chromatographie.
Papier-Chromatographie (PC)
Die Papierchromatographie (PC) stellt ein Trennverfahren der planaren Chromatographie dar. Bei diesem papierbasierten Verfahren dient Papier mit definierten Eigenschaften hinsichtlich Reinheit, Qualität und Konsistenz als stationäre Phase. Durch die Kapillarwirkung wird die mobile Phase von unten nach oben gezogen. Die einzelnen Bestandteile des Gemischs durchdringen diesen Träger mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und es erfolgt eine Auftrennung des Startpunkts in verschiedene Punkte des Substanzgemisches. Das Ergebnis (Chromatogramm) sind Substanzflecken auf dem Papier, die Aufschluss über die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten geben. Die Trennungsgeschwindigkeit hängt von den Adsorptionskräften (Adsorption = Anlagerung) zwischen stationärer und mobiler Phase ab. Die am leichtesten adsorbierbaren Substanzen werden bereits in der Nähe des Startpunktes festgehalten.

Die Papierchromatographie eignet sich für kleine Substanzmengen im Bereich zwischen 5 bis 50 Mikrogramm. In Abhängigkeit von der Fließrichtung des Laufmittels lassen sich noch die absteigende und die Rundfilter- oder Zirkularmethode als weitere Varianten nennen.

Carl ROTH bietet Ihnen eine Vielzahl von Chromatographie-Papieren sowie maschinenglatte Papiere, weiche Kartons als auch entfettetes Papier.
Nützliche Werkzeuge für das Chromatographie-Labor