Vertikale Elektrophorese (PAGE)

Polyacrylamid-Gele bestehen im Wesentlichen aus den Stoffen Acrylamid und 2‘-2‘- Methylenbisacrylamid, die durch eine radikalische Polymerisation miteinander vernetzt wurden. Das Acrylamid bildet hierbei lineare Polyacrylamid-Ketten, die durch das Methylenbisacrylamid quervernetzt werden. Die Porengröße des Gels wird bestimmt durch die Gesamtkonzentration an Acrylamid und Bisacrylamid (% T), üblicherweise im Verhältnis 29:1 bis 37,5:1, und der Konzentration an Bisacrylamid (% C). Je höher die Gesamtkonzentration von Acrylamid und Bisacrylamid, desto feinporiger ist das Gel. Hinsichtlich des Bisacrylamids ergibt ein prozentualer Anteil von 5 % die kleinsten Poren.

Weitere Komponenten, die für die Herstellung eines PAGE-Gels gebraucht werden, sind eine adäquate Pufferlösung, meist SDS-PAGE/Lämmli-Puffer (Auftrennung von Proteinen) oder TBE-Puffer (Auftrennung von Nukleinsäuren), Ammoniumperoxodisulfat (APS) als Radikalstarter und Tetramethylendiamin (TEMED) als Polymerisierungskatalysator. Die Gesamtkonzentration (% T) von Acrylamid und Bisacrylamid zur Herstellung eines Gels beträgt üblicherweise 6-15 %, je nach Größe der aufzutrennenden Biomoleküle. 

Bei einer häufig verwendeten Form der Proteinelektrophorese, der diskontinuierlichen SDS-PAGE, wird ein zweiphasiges Gel hergestellt. Hierfür werden zwei Gellösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen und pH-Werten angesetzt – die Gellösung der höheren Konzentration und einem basischen pH wird zuerst gegossen, sie bildet das Trenngel. Die Gellösung mit der niedrigeren Konzentration und einem neutralen pH wird das Sammelgel. Die Proben werden in das Sammelgel pipettiert und konzentrieren sich am Übergang vom Sammelgel zum feinporigeren Trenngel. Dadurch wird der Gellauf optimiert und die Banden erscheinen besonders scharf.

Acrylamid ist ein starkes Nervengift, welches sowohl über die Haut, wie auch durch die Atemwege aufgenommen werden kann. Um die Handhabung zu erleichtern und Gesundheitsrisiken einzudämmen, bietet Ihnen Carl Roth eine ganze Reihe an Fertiggellösungen und Fertiggelen.

Die PAGE wird in einer vertikalen Kammer durchgeführt. Für die Herstellung des Gels werden zwei Glasplatten (eine Standard- und eine Ohrenglasplatte mit einem Spacer dazwischen) aneinandergelegt und in einem Laufmodul auf einem Gelgießstand eingespannt. Die Ohrenglasplatte ist nach innen ausgerichtet und das Gel wird zwischen die Glasplatten gegossen. Sobald das Gel auspolymerisiert ist, kann das Laufmodul mit den Glasplatten in eine vertikale Kammer gesetzt werden und, nach Zugabe des Laufpuffers und der Proben, der Gellauf gestartet werden. 

Unsere Kammern gibt es in drei verschiedene Größen. Im Lieferumfang sind mindestens eine Elektrophoresekammer mit Puffertank, Sicherheitsdeckel und zwei Kabeln, ein Laufmodul mit praktischem Schnellspannmechanismus, ein Kühlpad zur Gelkühlung und eine Ausgleichsplatte enthalten.  Wir haben für jede Kammer ein großes Zubehör an Kämmen, Glasplatten und Spacern und alle Teile der Kammer können als Ersatzteile bei uns erworben werden.

Zur Auftrennung von Biomolekülen in der PAGE braucht man einen Laufpuffer, durch welchen der Strom fließen kann, einen Ladepuffer, der die Probe beschwert und die Laufweite markiert, sowie einen Marker zur Größenabschätzung. 

Bei der Auftrennung von Proteinen in der PAGE wird als Laufpuffer meist der SDS-PAGE Puffer nach Lämmli verwendet. SDS ist ein anionisches Tensid, das die Eigenladung der Proteine überdeckt und sie denaturiert, wodurch die Proteine entfaltet und linearisiert werden. Der Ladepuffer dient bei der Protein-Elektrophorese dem Schutz der Probe und der Probenvorbereitung. In den meisten Ladepuffern ist ebenfalls SDS- oder ein vergleichbares Detergenz enthalten. Manche Ladepuffer haben zusätzlich reduzierende Eigenschaften und können dadurch hartnäckige Disulfidbrücken auflösen. Die Proteinmarker decken verschiedene Größenbereiche ab und sind acyliert und vorreduziert.

Für die Auftrennung von Nukleinsäuren in der PAGE, wird meist TBE-Puffer als Laufpuffer verwendet. Die Ladepuffer enthalten unterschiedliche Farbstoffkombinationen und können entsprechend der aufzutrennenden Fragmentgröße ausgewählt werden. DNA-Marker gibt es in verschiedenen Größenbereichen und zur Quantifizierung auch in äquimolarer Verteilung.

Zur Detektion von Proteinen in der PAGE wird das Gel meist mit Coomassie™-Blau angefärbt, da dieser Farbstoff an die basischen Seitenketten von Aminosäuren bindet und so einen stabilen Komplex mit den Proteinen bildet. Bei herkömmlichen Coomassie™-Färbelösungen wird auch der Gelhintergrund angefärbt, weshalb die Gele erst wieder mit einer Methanollösung entfärbt werden müssen. Moderne Färbelösungen mit kolloidalem Coomassie sind sensitiver und binden spezifisch an die Proteine, weshalb ein Entfärben des Hintergrunds nicht mehr notwendig ist. Alternativ zur Coomassie™-Färbung, können die Proteine mit einer hochsensitiven Silberfärbung angefärbt werden.

Auch Nukleinsäuren können in PAGE-Gelen mit einer Silberfärbung visualisiert werden. Dadurch können auch geringste Mengen detektiert werden.

Wenn Biomoleküle nach der PAGE aufgereinigt oder weiteruntersucht werden sollen, müssen sie zunächst aus dem Gel extrahiert werden. Hierfür wird das betreffende Gelstück ausgeschnitten und kann dann beispielsweise in ein Elutionsgefäß überführt werden, in welchem es durch Dialyse und Elektroelution entsalzt und aufgereinigt werden kann. Die aufgereinigte Probe kann anschließend durch Fällung oder Ultrafiltration aufkonzentriert werden. 

Zum qualitativen und spezifischen Nachweis einzelner Proteine oder Proteinmodifikationen, kann nach der PAGE ein Western-Blot durchgeführt werden. Hierfür müssen die Proteine aus dem Gel zunächst auf eine geeignete Membran, z.B. aus Polyvinylidendifluorid (PVDF), Nitrocellulose (NC) oder Nylon, übertragen werden. Die Übertragung der Proteine auf die Membran kann entweder über einen Elektroblot oder einen Kapillartransfer erfolgen. Für den Aufbau der Kapillarkraft, braucht man beim Kapillartransfer noch Blottingpapiere die über die Membran und unter das Gel gelegt werden. Der Kapillartransfer kann entweder in  einem Blotting-Tank oder in einem Semi-Dry-Blotter durchgeführt werden. 

Zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in der Kammer, wird ein Power Supply benötigt, welcher den elektrischen Strom in die richtige Spannung umwandelt. Unsere Power Supplies gibt es mit verschiedenen technischen Parametern, für die Nutzung von Geräten verschiedener Größen, oder für den Anschluss von mehreren Kammern. Unsere Power Supplies lassen sich leicht bedienen, haben einen Timer mit Alarmfunktion und einen hohen Sicherheitsstandard.