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Chromatographie

La chromatographie est une méthode biophysique centrale qui permet la séparation, l'identification, la quantification et la purification des composants d'un mélange en vue d'une analyse qualitative et quantitative.

La méthode est basée sur les interactions spécifiques des composants à séparer avec deux phases non miscibles, une phase stationnaire et une phase mobile. Les substances peuvent être séparées avec la phase stationnaire sur la base d'une variété de méthodes et de la présence de propriétés telles que la taille et la forme, la charge totale, les groupes hydrophobes présents à la surface et la capacité de liaison.

En chromatographie, on distingue donc différentes méthodes de séparation ou applications en fonction de la composition des phases.

Quels que soient vos besoins, Carl ROTH vous propose une gamme complète de produits pour votre laboratoire de chromatographie.
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Chromatographie en phase gazeuse (CG)
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une méthode d'analyse très courante pour la séparation des composés volatils dans un flux gazeux continu, la phase mobile. Le principe de base du processus de séparation est que les composants d'un échantillon ont des pressions de vapeur différentes et entrant donc dans la phase gazeuse à des vitesses différentes.

Un gaz inerte (également appelé gaz vecteur) transporte les composants à séparer et n'interagit pas avec l'échantillon ou avec les composants de la colonne. Les gaz courants utilisés en chromatographie en phase gazeuse sont, par exemple, l'azote (N2), l'hélium (He) et l'hydrogène (H2). Les phases stationnaires utilisées sont formellement classées dans les colonnes dites à garnissage et les colonnes capillaires. De nos jours, les colonnes capillaires sont principalement utilisées. La phase stationnaire y est uniformément revêtue sur la surface interne de la colonne d'un film de liquide de haut poids moléculaire et peu volatil.
​​​​​​Cela signifie que la longueur du trajet parcouru par les molécules individuelles dans la phase gazeuse varie moins. Il en résulte une efficacité de séparation accrue - contrairement aux colonnes garnies, qui remplissent toute la cavité de la colonne.

Le CPG se caractérise par sa grande sensibilité, sa bonne reproductibilité pour des déterminations quantitatives précises ainsi que son large éventail d'applications grâce à la grande sélection de phases stationnaires.

Chez Carl ROTH, vous trouverez le bon produit pour chaque application.
Chromatographie liquide (LC, CLHP, LC-MS )
La chromatographie liquide est un terme collectif qui désigne toutes les méthodes chromatographiques dans lesquelles les liquides sont utilisés comme phases mobiles.

Cela comprend les techniques de séparation suivantes :
  • Chromatographie sur papier (PC),
  • Chromatographie sur couche mince (CCM) et
  • Chromatographie sur colonne
    • Chromatographie liquide à basse pression / Chromatographie flash (FC)
    • Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
    • Chromatographie par échange d'ions (CI)
    • Chromatographie par perméation de gel (GPC)
    • Adsorption / Chromatographie d'affinité (AC)
Cette méthode de séparation est basée sur le fait que les substances d'un mélange sont dissoutes dans la phase mobile et interagissent avec la phase stationnaire avec une sélectivité suffisante. En fonction des propriétés moléculaires, un processus de tri a lieu dans la phase stationnaire. La composition de la phase mobile peut également être modifiée par étapes, en fonction du type de substances à séparer (gradient). Cela permet d'utiliser aujourd'hui diverses méthodes pour étudier des classes de substances très différentes. La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) s'est développée à partir de la chromatographie sur colonne classique. Une meilleure séparation a été obtenue en réduisant la taille des particules du matériau de la colonne à 10 μm. Cependant, cela nécessite une pression plus élevée pour déplacer la phase mobile dans la colonne. La CLHP permet une meilleure résolution de la séparation, une plus grande précision et une meilleure sensibilité de détection en moins de temps que les méthodes classiques.
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La CLHP est une technique à haute résolution pour la séparation et la quantification d'un certain nombre de petites molécules, de biomolécules et de peptides. Elle est particulièrement adaptée à l'analyse des substances peu volatiles ou non volatiles, ainsi que des substances hautement polaires ou ioniques, des substances à forte masse moléculaire et des substances thermiquement instables et facilement décomposables. C'est l'une des techniques les plus fréquemment utilisées dans l'analyse instrumentale, mais elle peut également être utilisée pour le traitement préparatoire des composés.

L'information physique qui en résulte est convertie en signaux électriques (signaux analogiques) à la fin de la colonne du système CLHP par différents types de détecteurs. Ils rendent les informations analytiques de la séparation chromatographique mesurables et visibles. Ce n'est pas la distance parcourue qui est mesurée, mais le temps (temps de rétention tR) nécessaire aux différents composants pour traverser l'ensemble du matériau d'emballage.

L'identification et/ou la quantification des substances est également possible en couplant la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse (LC-MS, CLHP -MS).
Améliorez la performance de votre système CLHP Carl ROTH vous propose des solvants de haute qualité pour CLHP et LC-MS, des substances de référence, des flacons pour échantillonneur automatique et d'autres accessoires CLHP.
Chromatographie sur couche mince (CCM, HPTLC)
La chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC pour Thin Layer Chromatography) est une technique de séparation analytique et préparative utilisée en chromatographie planaire. Elle permet de séparer un échantillon en ses composants et de le déterminer rapidement et à faible coût.

Le principe de séparation de la chromatographie sur couche mince est basé sur le fait que la phase liquide mobile (solvants ainsi que mélanges de solvants ; également appelé solvant courant) se déplace à travers un agent sorbant approprié comme une phase stationnaire en raison des effets capillaires. La phase stationnaire se trouve en fine couche sur divers matériaux de support (verre, polyester ou aluminium). Dans cette couche, la séparation s'effectue par élution avec le solvant courant. Pour chaque composant de l'échantillon, il existe un équilibre dynamique entre la phase liquide et la phase absorption.

Les différents composants de l'échantillon sont transportés par la phase mobile à différentes distances et peuvent être reconnus dans le chromatogramme comme des points séparés. Dans le meilleur des cas, les substances séparées sont colorées de telle manière que la position de la bande peut être reconnue par la couleur intrinsèque de la substance. Dans le cas contraire, elles peuvent être rendues visibles sous lumière UV. Si le matériau de la couche contient un indicateur de fluorescence, ces substances apparaissent sous forme de points sombres en raison de l'extinction de la fluorescence ("fluorescence quenching"). Si elles n'apparaissent pas sous la lumière UV, l'échantillon peut également être dérivatisé à l'aide de chromophores, qui lui donnent une couleur visible à l'œil nu, les réactifs nécessaires étant soit pulvérisés, soit appliqués par immersion.
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Pour pouvoir comparer différentes CCM, on calcule les valeurs dites Rf (Retention Factor). La valeur Rf est définie comme le rapport entre la distance parcourue par la substance (S) et la distance parcourue par le front du solvant (L) :



Cela permet de comparer les résultats de différents chromatogrammes sur couche mince, car cette valeur est une constante spécifique à chaque substance, avec le même choix de composition de la phase mobile et de la phase stationnaire. Ainsi, les composants individuels peuvent également être identifiés par la comparaison avec une référence.
En tant que méthode analytique, la chromatographie sur couche mince est excellente pour trouver le bon rapport de solvants pour les méthodes préparatoires ultérieures (par exemple, la chromatographie sur colonne).

Par rapport à la chromatographie sur papier (PC), la chromatographie sur couche mince présente de nombreux avantages :
  • meilleure séparation des substances,
  • une séparation plus rapide,
  • phase stationnaire robuste et support robuste (réactifs de détection presque librement sélectionnables),
  • différentes phases stationnaires peuvent être utilisées.
Grâce à ces nouveaux développements, la chromatographie sur couche mince a largement remplacé la chromatographie sur papier dans l'analyse de routine.
En plus des couches de gel de silice classiques, il existe déjà un large éventail de solutions de rechange sur le marché :
  • Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC)
    ​​​​​​La HPTLC représente une amélioration par rapport à la CCM classique en termes d'efficacité de séparation, de temps nécessaire et de consommation de matériaux.
    En utilisant des particules de gel de silice de très petite taille et une densité de tassement accrue du gel sur la plaque, la résolution et la précision de la HPTLC ont été grandement améliorées. La surface de la plaque est lisse et permet une séparation efficace. Des analyses plus rapides et plus sensibles sont possibles. Cette méthode fournit des bandes nettes et très reproductibles pour l'analyse quantitative et est donc également idéale pour les applications assistées par des instruments.
  • Plaques de gel de silice modifié
    Alors que le gel de silice non modifié (SiOH) porte sur sa surface des silanols et des siloxanes polaires, dans les gels de silice modifiés en surface, d'autres groupes fonctionnels (par exemple des groupes amino) sont liés à ces groupes polaires afin de modifier les propriétés de surface du gel de silice de la manière souhaitée. Ils diffèrent du gel de silice standard non seulement par leur polarité mais aussi par leur basicité et conduisent ainsi à des résultats de séparation complètement différents.
  • Chromatographie sur couche mince en phase inversée (RPTLC)
    ​​​​​​En chromatographie en phase inversée, le matériau de remplissage est toujours hydrophobe (non polaire) alors que la phase mobile est polaire. Par alkylation des groupes Si-OH à la surface du gel de silice, par exemple avec des chaînes C2, C4, C8 ou C18, l'ordre dans lequel les différentes molécules de l'échantillon sont séparées est inversé - les molécules polaires courent plus vite, les molécules non polaires sont mieux maintenues. Comme il s'agit d'une inversion des relations de phase classiques, on parle de chromatographie sur couche mince en "phase inversée". Cela signifie que même les substances fortement polaires peuvent être étudiées en utilisant du gel de silice à phase inversée.
  • D'autres phases stationnaires appropriées pour la CCM sont l'oxyde d'aluminium (ALOX), le silicate de magnésium, le kieselguhr, le polyamide, la cellulose.
Nos plaques CCM ainsi que nos plaques HPTLC sont disponibles avec des plaques de verre, des films polyester POLYGRAM® et des films aluminium ALUGRAM® dans une variété de formats, ce qui les rend adaptées à de nombreuses applications de séparation. Disponibles avec et sans silicate de zinc activé au manganèse comme indicateur de fluorescence avec une fluorescence verte en lumière UV à ondes courtes (254 nm, UV254).

​​​​​​​Plaques de verre : Verre d'environ 1,3 mm d'épaisseur, très résistant à l'emballage et au stockage, stabilité idéale à la torsion, stabilité à haute température, fragile, ne peut être coupé, grande résistance aux solvants, aux acides minéraux et à l'ammoniac conc. selon la phase, convient aux réactifs de détection aqueux.

POLYGRAM® : Polyester, environ 0,2 mm d'épaisseur, faible coût d'emballage et de stockage, faible stabilité à la torsion, max. 185 stabilité à la température, incassable, peut être coupé, haute résistance aux solvants, aux acides minéraux et à l'ammoniac concentré, convient bien aux réactifs de détection aqueux. Le système de liant des films POLYGRAM® est stable même dans les éluants aqueux purs.

ALUGRAM® : Aluminium, environ 0,15 mm d'épaisseur, faible effort pour l'emballage et le stockage, stabilité à la torsion relativement élevée, stabilité à haute température, incassable, peut être coupé, haute résistance aux solvants, faible résistance aux acides minéraux et à l'ammoniac conc., convient peu aux réactifs de détection aqueux.​​
Chromatographie sur colonne (CC, chromatographie flash)
La chromatographie sur colonne classique est une méthode de séparation préparative dans laquelle la phase stationnaire est introduite dans des tubes de verre - des colonnes de séparation - disposés pour la plupart verticalement. La séparation est basée - comme dans la chromatographie sur couche mince (CCM) - sur le comportement de sorption variable de différentes substances en solution (phase mobile) sur la phase stationnaire.
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La phase stationnaire est généralement constituée de gel de silice, de cellulose ou d'oxyde d'aluminium finement pulvérisé. Comme ces matériaux sont également disponibles sous forme de couches de plaques CCM pré-revêtues, la chromatographie sur couche mince peut être utilisée pour analyser le problème de séparation en premier lieu. La polarité de la phase mobile doit être adaptée aussi précisément que possible au problème de séparation spécifique. À cette fin, des mélanges de solvants polaires et non polaires sont utilisés.
Les différents composés du mélange interagissent différemment avec la phase stationnaire en fonction de leur composition chimique et sont donc élués en différentes fractions. Ces séparations peuvent être accélérées si la phase mobile est pressée à travers la phase stationnaire avec de l'air comprimé au lieu de l'effet gravitationnel du surnageant (ce qu'on appelle la "chromatographie flash"). La performance de séparation de la colonne est même augmentée par cette méthode, car les zones ont moins de temps pour s'étendre par diffusion dans la direction de l'écoulement. Contrairement à la CLHP, en chromatographie flash, les mélanges de substances sont séparés en phases normales (souvent du gel de silice non modifié) à l'aide d'une pression assez basse (2–25 bars).

La chromatographie flash est particulièrement adaptée à la purification préparatoire de grandes quantités de substances, de l'échelle du microgramme à celle du kilogramme. Comparée à la séparation CLHP préparative, cette méthode de séparation est moins coûteuse et prend moins de temps. Elle peut être effectuée soit manuellement avec peu d'équipement, soit automatiquement avec un équipement approprié.

Chez Carl ROTH, vous trouverez un grand choix de colonnes préemballées sous forme de cartouches en plastique avec différents matériaux d'emballage, des colonnes en verre que vous pouvez emballer vous-même et d'autres accessoires pour la chromatographie flash.​​
Chromatographie sur papier (PC)
La chromatographie sur papier (PC) est une méthode de séparation de la chromatographie planaire. Dans ce procédé basé sur le papier, le papier ayant des propriétés définies en matière de pureté, de qualité et de consistance sert de phase stationnaire. En raison de l'action capillaire, la phase mobile est tirée de bas en haut. Les différents composants du mélange pénètrent dans ce support à des vitesses différentes et le point de départ est séparé en différents points du mélange de substances. Il en résulte (chromatogramme) des points de substance sur le papier, qui donnent des informations sur les différentes vitesses de migration. La vitesse de séparation dépend des forces d'adsorption (adsorption = fixation) entre les phases stationnaire et mobile. Les substances les plus facilement adsorbées sont déjà retenues près du point de départ.
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La chromatographie sur papier convient aux petites quantités de substances comprises entre 5 et 50 microgrammes. Selon le sens d'écoulement du milieu en mouvement, la méthode descendante et la méthode du filtre rond ou circulaire peuvent être nommées comme variantes supplémentaires.

Carl ROTH vous propose une large gamme de papiers de chromatographie ainsi que des papiers lisses à la machine, des cartons souples et des papiers dégraissés.​​​​​​
Outils utiles pour le laboratoire de chromatographie